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Neuron | 林睿實驗室和北京腦所羅敏敏實驗室合作開發(fā)神經(jīng)元高亮標(biāo)記技術(shù)LINCS，構(gòu)建新一代單神經(jīng)元重構(gòu)平臺
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Introduction
哺乳動物大腦是由海量異質(zhì)性神經(jīng)元相互連接構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。要解析其組織規(guī)則與功能連接，必須進行高分辨率神經(jīng)元重構(gòu)?；陔娮语@微鏡（EM）的方法已在小型模式生物（如果蠅、線蟲）中取得了較完整的突觸級連接組解析成果1,2。然而，由于其極高的技術(shù)復(fù)雜度和處理哺乳動物（如小鼠）完整大腦等大型組織所產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)規(guī)模，這一方法仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，在介觀層面（mesoscale，即細胞水平）實現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)精準(zhǔn)重構(gòu)，是目前解析大型復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的最可行且最具前景的途徑。當(dāng)前，介觀層面的單神經(jīng)元重構(gòu)主要依賴熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合切片式亞微米級光學(xué)成像。此方案雖然已較為成熟，但仍受限于冗長的樣品制備與成像周期，以及對定制化成像設(shè)備的需求。近年來，組織透明化技術(shù)與光片顯微鏡成像的快速發(fā)展為解決這些難題帶來了希望；然而，真正應(yīng)用于實現(xiàn)單神經(jīng)元精度重構(gòu)仍需克服關(guān)鍵技術(shù)障礙：透明化過程常導(dǎo)致現(xiàn)有熒光蛋白標(biāo)記淬滅；替代的信號放大方法（如抗體染色）則存在組織穿透力弱、耗時久或信號強度不足等局限；同時，獲得理想的單神經(jīng)元數(shù)據(jù)還需要開發(fā)可控的稀疏標(biāo)記策略。綜合這些挑戰(zhàn)，領(lǐng)域內(nèi)亟需開發(fā)一種高效、可擴展、且能與主流成像及透明化技術(shù)兼容的新型標(biāo)記方法。
2025年9月18日，北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院林睿實驗室與北京腦科學(xué)與類腦研究所羅敏敏實驗室在《Neuron》期刊在線發(fā)表了題為“Ultrabright Chemical Labeling Enables Rapid Neural Connectivity Profiling in Large Tissue Samples ”的NeuroResource文章，提出了一種高亮的小鼠全腦/全身神經(jīng)元快速化學(xué)熒光標(biāo)記方法LINCS（Labeling Individual Neurons with Chemical dyes and Controllable Sparseness）。該方法兼容組織透明化方法與光片顯微成像技術(shù)，并簡化了樣本制備流程，實現(xiàn)快速、高亮且均勻的標(biāo)記。同時，該研究開發(fā)了穩(wěn)定稀疏度的神經(jīng)元稀疏標(biāo)記策略，通過將LINCS與不同的稀疏標(biāo)記策略結(jié)合，建立了新一代基于光片顯微成像的全腦單神經(jīng)元重構(gòu)方案。
LINCS 利用鄰近標(biāo)記（proximity labeling）方法，通過結(jié)合 Cre 依賴型 AAV 與特定 Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠品系在神經(jīng)元中表達可溶性增強型工程化生物素連接酶（solubility-enhanced TurboID, seTurboID），并為小鼠提供生物素飲水。生物素擴散入細胞后被 seTurboID 催化，共價標(biāo)記至胞內(nèi)蛋白，完成神經(jīng)元的高效在體生物素化(圖1)。隨后，LINCS通過熒光染料偶聯(lián)的鏈霉親和素（Streptavidin）進行全腦染色，將生物素標(biāo)記轉(zhuǎn)化為熒光信號，從而實現(xiàn)細胞類型和神經(jīng)環(huán)路特異性的靶向神經(jīng)元標(biāo)記。
在開發(fā)過程中，研究人員解決了兩個關(guān)鍵技術(shù)問題。首先，針對研究初期發(fā)現(xiàn)的原始 TurboID 在神經(jīng)元內(nèi)表達不足的問題，研究人員將 TurboID 與促溶標(biāo)簽 GB1 融合改造為 seTurboID，使其在神經(jīng)元胞體及長距離投射末端的表達顯著增強，從而實現(xiàn)生物素標(biāo)記沿長軸突神經(jīng)元的完整覆蓋(圖1)。其次，研究人員發(fā)現(xiàn)野生型鏈霉親和素（四聚體，含 4 個生物素結(jié)合位點）在大組織樣品染色中存在組織滲透性差和非特異性血管結(jié)合高等問題。研究者通過應(yīng)用經(jīng)過工程化改造、僅保留一個活性結(jié)合位點的單價鏈霉親和素(monovalent Streptavidin)，徹底解決了深層穿透障礙和非特異性結(jié)合問題，并仍然維持與生物素分子結(jié)合的高親和力與穩(wěn)定性(圖2)。
圖1
LINCS原理設(shè)計
通過將 seTurboID在體標(biāo)記、單價鏈霉親和素染色和DISCO有機相透明化技術(shù)相結(jié)合，研究者成功建立了LINCS全流程(圖2)。LINCS在樣品制備效率上具有顯著優(yōu)勢：不同于現(xiàn)有方法（如iDISCO+4和vDISCO5）依賴長達1個月以上的熒光蛋白表達和2周以上的抗體染色（總樣品制備耗時18-23天），LINCS僅需3周的seTurboID表達聯(lián)合3天的染色即可完成樣品制備（染色+透明化步驟僅需約1周）。效率提升的同時，LINCS樣本還具備更亮、更均勻的信號特性，并能處理大體積樣品(圖2)。這使其成功實現(xiàn)了（1）在小鼠完整大腦-脊髓樣品內(nèi)對皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)元的標(biāo)記；（2）通過心臟灌流對成年小鼠全身外周神經(jīng)元的染色標(biāo)記（染色時間均為3天）。此外，LINCS還可兼容膨脹顯微鏡（Expansion Microscopy），并可與iDISCO+抗體染色聯(lián)用實現(xiàn)多重標(biāo)記。
圖2
LINCS在大體積組織樣品中實現(xiàn)快速高亮神經(jīng)元標(biāo)記
為實現(xiàn)全腦單神經(jīng)元重構(gòu)，研究者將LINCS與多種稀疏標(biāo)記策略整合，包括團隊前期開發(fā)的雙AAV稀疏標(biāo)記系統(tǒng)（dual-AAV sparse labeling）6，以及本工作新開發(fā)的基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)Cre基因敲除的穩(wěn)定稀疏標(biāo)記系統(tǒng)（Cre-KO sparse labeling）。運用該整合平臺，研究者成功重構(gòu)了11個紋狀體投射的中腦多巴胺能神經(jīng)元、7個中腦GABA能神經(jīng)元及5個導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray）投射的下丘腦GABA能神經(jīng)元。相較于目前主流單細胞重構(gòu)平臺，基于LINCS的方案在成像效率（約0.3天/全腦 vs 7-14天）和數(shù)據(jù)量（約100GB/全腦 vs >10TB）上均實現(xiàn)數(shù)量級優(yōu)化。
圖3
基于LINCS的全腦單神經(jīng)元重構(gòu)方案
綜上，LINCS是一種基于鄰近生物素化標(biāo)記-化學(xué)熒光放大的高亮神經(jīng)元標(biāo)記技術(shù)。通過創(chuàng)新性的結(jié)合工程化seTurboID與單價鏈霉親和素，LINCS突破了現(xiàn)有方案在標(biāo)記速度、信號強度與均勻性、以及組織穿透性上的核心瓶頸。LINCS 流程大幅簡化，可適配從全腦到全身的跨尺度樣本，并兼容多模態(tài)技術(shù)，為神經(jīng)元連接組學(xué)研究提供了高效、穩(wěn)定、易用且可擴展的解決方案。
北京生命科學(xué)研究所林睿實驗室博士后鐘詩琳博士為該論文第一作者，北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)交叉醫(yī)學(xué)研究院林睿博士與北京腦科學(xué)與類腦研究所羅敏敏博士為共同通訊作者。該論文的其他作者還包括北京生命科學(xué)研究所林睿實驗室博士研究生張曉婷、北京腦科學(xué)與類腦研究所光學(xué)影像中心工程師高辛未、西安交通大學(xué)軟件學(xué)院李鐘毓博士、北京腦科學(xué)與類腦研究所龔蓉實驗室博士研究生黃林鈴、北京腦科學(xué)與類腦研究所光學(xué)影像中心主任郭青春博士、北京腦科學(xué)與類腦研究所龔蓉博士、MRC分子生物學(xué)實驗室任婧博士。
本研究受科技部科技創(chuàng)新2030-腦科學(xué)與類腦研究項目、國家自然科學(xué)基金、北京市科技新星計劃、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)創(chuàng)新單元、新基石研究員項目和北京市政府的資助。
參考文獻
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/ 可見文末“閱讀原文” /
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.08.022
