2025年9月10日，北京生命科學(xué)研究所 / 清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院劉臻實(shí)驗(yàn)室與黃牛團(tuán)隊(duì)合作，在《Nature Synthesis》雜志發(fā)表了題為“Molecular-dynamics-simulation-guided directed evolution of flavoenzymes for atroposelective desaturation”的研究論文。該研究報(bào)道了一種基于定向進(jìn)化策略開發(fā)的創(chuàng)新性生物催化方法，研究團(tuán)隊(duì)利用來(lái)源于Parageobacillus thermantarcticus的黃素酶PtOYE，通過(guò)工程化改造獲得了具有對(duì)映選擇性去飽和活性的變體，從而實(shí)現(xiàn)了軸手性聯(lián)芳基化合物的高效合成。值得一提的是，分子動(dòng)力學(xué)模擬 (MD simulation) 在定向進(jìn)化進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，該技術(shù)揭示了催化反應(yīng)過(guò)程中酶的潛在構(gòu)象變化，并在此基礎(chǔ)上識(shí)別出此前在PtOYE及其同類酶中未被發(fā)現(xiàn)的重要?dú)埢?/span>以此為指導(dǎo)獲得的工程化酶ADes-5相較于初始變體（PtOYE-Y28F），其催化效率 (k_cat/K_M ）提升了70倍以上。此外，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)X射線晶體學(xué)手段解析了ADes-5的結(jié)構(gòu) (PDB：9IUV)，確定了其活性中心和整體的結(jié)構(gòu)特征。該工程化酶能夠?qū)⒍喾N1-芳基-2-四氫萘酮底物以很高的收率和良好的對(duì)映選擇性轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的聯(lián)芳基產(chǎn)物，進(jìn)一步的衍生反應(yīng)展示了合成產(chǎn)物在多官能團(tuán)軸手性分子構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用潛力。本研究不僅展示了酶催化脫氫反應(yīng)在軸手性選擇性合成中的潛力，也突顯了黃素酶在合成軸手性分子方面的重要能力，對(duì)有機(jī)合成與藥物發(fā)現(xiàn)都具有重大意義。同時(shí)，本研究也驗(yàn)證了MD在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)潛在構(gòu)象變化并揭示蛋白功能的結(jié)構(gòu)機(jī)制中的準(zhǔn)確性和重要作用。

軸手性化合物的生物催化策略

實(shí)驗(yàn)人員從底物1a的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分為切入點(diǎn)，開展了酶催化軸手性脫氫反應(yīng)的系統(tǒng)研究。首先，作者用實(shí)驗(yàn)室自有酶庫(kù)中的黃素酶對(duì)1a的去飽和反應(yīng)性進(jìn)行了評(píng)估，其中活性最高的是PtOYE-Y28F (ADes-1)，對(duì)映選擇性為82%，催化產(chǎn)率僅為2.2%。為提升ADes-1的催化性能，研究團(tuán)隊(duì)隨后針對(duì)已知影響PtOYE及其同源酶多種酶促反應(yīng)效率的八個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了位點(diǎn)飽和突變。盡管進(jìn)行了大量篩選，僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)有益突變A104G，其對(duì)產(chǎn)率和對(duì)映選擇性的改善非常有限。

為提高篩選效率，作者采用了MD模擬指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程策略。作者首先基于AlphaFold2預(yù)測(cè)的ADes-1結(jié)構(gòu)以及PtOYE的催化機(jī)制，將底物1a的兩種對(duì)映體分別對(duì)接至酶的活性口袋中。其中R構(gòu)型由于在對(duì)接過(guò)程中與活性位點(diǎn)存在嚴(yán)重空間位阻而被排除；而 (S)-1a存在兩種可能的結(jié)合模式，這兩種結(jié)合模式的主要差異存在于萘環(huán)取向：在Conf-I模式中，底物甲氧基朝向活性位點(diǎn)外側(cè)；Conf-II模式中，底物甲氧基朝向活性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)并與S249和R215形成相互作用（圖2b）。

作者在此基礎(chǔ)上對(duì)兩種結(jié)合模式的復(fù)合物結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行了MD模擬，模擬結(jié)果顯示在Conf-II模式中，隨著底物分子的結(jié)合，PtOYE蛋白發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化：Loop I和Loop II之間的“鎖扣”結(jié)構(gòu)打開，同時(shí)Loop I向內(nèi)關(guān)閉穩(wěn)定了底物結(jié)合（圖2d）；而在Conf-I模式的MD結(jié)果中，未觀察到類似的構(gòu)象變化，同時(shí)底物分子結(jié)合不穩(wěn)定（圖2c）。MD模擬說(shuō)明了Conf-II模式的合理性以及構(gòu)象變化在穩(wěn)定底物結(jié)合過(guò)程中的重要性，揭示了PtOYE催化底物反應(yīng)的潛在結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)機(jī)制。

對(duì)模擬結(jié)果中的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步可視化分析表明：(1) 在初始構(gòu)象中，Loop II上的F124與Loop I上的P255和A252通過(guò)疏水相互作用形成“鎖扣”結(jié)構(gòu)，限制了Loop I的閉合；(2) 在最終的Loop I“閉合”構(gòu)象中，疏水殘基V254靠近底物并形成新的相互作用（圖2d）?；谶@些結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)信息，作者對(duì)F124、V254和P255三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了位點(diǎn)飽和突變篩選，旨在打破“鎖扣”構(gòu)象并穩(wěn)定“閉合”構(gòu)象，從而促進(jìn)底物的結(jié)合和催化。篩選得到的F124Q與V254F變體分別對(duì)反應(yīng)收率提升了3.8倍和3.4倍，二者組合后得到的雙突變體ADes-4，使產(chǎn)率提升至50%，對(duì)映選擇性達(dá)到88% e.e.。進(jìn)一步在A252位點(diǎn)進(jìn)行突變和篩選，獲得了催化性能最優(yōu)的ADes-5，其產(chǎn)率高達(dá)98%，對(duì)映選擇性為89% e.e.，和初始變體ADes-1相比，產(chǎn)率提升了45倍。

分子動(dòng)力學(xué)模擬指導(dǎo)的定向進(jìn)化

為深入理解蛋白質(zhì)工程對(duì)于軸手性脫氫酶性能的影響，作者測(cè)定了進(jìn)化譜系中四個(gè)ADes變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)124Q和V254F兩個(gè)突變顯著提高了酶的催化活性，使ADes-4的催化速率 (k_cat) 和ADes-1相比提高了26倍，同時(shí)表現(xiàn)出更低的K_M值，表明底物親和力增強(qiáng)。最終獲得的ADes-5變體展現(xiàn)出最優(yōu)的催化性能，其催化效率k_cat/K_M較初始變體提高了70倍。這些觀察結(jié)果與作者基于MD模擬所建立的機(jī)制模型相一致。具體而言，當(dāng)F124和A252突變?yōu)橛H水殘基谷氨酰胺時(shí)，“鎖扣”構(gòu)象中Loop I和Loop II之間的疏水相互作用被削弱，加速了這兩個(gè)loop的分離，從而獲得更快的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。此外，V254F突變引入了芳香殘基苯丙氨酸，其芳環(huán)可與底物的π-電子體系之間形成π-π堆疊作用，增強(qiáng)了底物在催化構(gòu)型下的結(jié)合，從而提高了酶的活性。

ADes變體動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

在確定最優(yōu)變體ADes-5后，作者評(píng)估了其在多種1-芳基-2-四氫萘酮衍生物上的適用性。結(jié)果表明該酶對(duì)芳環(huán)的各種取代基都表現(xiàn)出顯著的耐受性，無(wú)論是鹵素、雜環(huán)還是氧化敏感的底物，均可被高效轉(zhuǎn)化為目標(biāo)聯(lián)芳基產(chǎn)物，且具有良好的產(chǎn)率與對(duì)映選擇性。除了1-萘基取代的四氫萘酮類化合物外，含有單芳環(huán)的底物也可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的聯(lián)芳基產(chǎn)物。值得注意的是， ADes-5在低溫條件 (4 °C) 下對(duì)某些在常溫下易發(fā)生消旋化的底物依然保持良好的去飽和活性，表明該酶在較寬的溫度范圍 (4–50?°C) 內(nèi)仍具有良好的穩(wěn)定性和催化能力。隨后，實(shí)驗(yàn)人員成功將這該酶催化反應(yīng)成功放大至毫摩爾級(jí)別，所獲得的聯(lián)芳基產(chǎn)物中的酚羥基部分可通過(guò) O-磺?；外Z催化的交叉偶聯(lián)反應(yīng)，高效轉(zhuǎn)化為多種功能化衍生物，包括芳基、硼基和膦基聯(lián)芳基化合物，而且在這些偶聯(lián)條件下沒(méi)有觀察到顯著的消旋化，這進(jìn)一步證明了該酶催化方法的實(shí)用性和目標(biāo)產(chǎn)物的合成價(jià)值。

酶催化反應(yīng)底物的拓展

制備級(jí)規(guī)模的放大和產(chǎn)物的衍生化

綜上所述，這項(xiàng)工作證明了黃素依賴的脫氫酶可以用于軸手性分子的合成，擴(kuò)大了這類酶的已知用途。同時(shí)，MD模擬有效預(yù)測(cè)了催化反應(yīng)過(guò)程中酶的構(gòu)象變化，并識(shí)別出以前在PtOYE和相關(guān)酶中未識(shí)別的重要?dú)埢?，表明通過(guò)調(diào)控柔性loop的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)可有效調(diào)節(jié)酶的催化活性，這一策略也為其他與生物催化轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白質(zhì)體系的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了重要參考。

本項(xiàng)目的主要內(nèi)容由劉臻實(shí)驗(yàn)室2022級(jí)TIMBR項(xiàng)目的博士研究生尹紅寧和黃牛實(shí)驗(yàn)室的博士研究生陳釗（現(xiàn)為博士后）完成。劉臻研究員和黃牛研究員為本文的通訊作者。本項(xiàng)目得到科技部、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院以及北京生命科學(xué)研究所的資助。

https://www.nature.com/articles/s44160-025-00882-9