2025年7月，《Nature》雜志在線發(fā)表了北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院徐墨課題組、中科院生物物理所高璞課題組、北生所/清華生物醫(yī)學(xué)交叉研究院邵峰課題組合作完成的題為“Epithelial cell membrane perforation induces allergic airway inflammation”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，在呼吸道上皮細(xì)胞膜上形成跨膜孔洞的活性，作為一種普適的二型免疫刺激，存在于多種過(guò)敏原中，此活性通過(guò)誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流和IL-33釋放，激活下游過(guò)敏反應(yīng)。這項(xiàng)研究揭示了過(guò)敏原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的共通分子機(jī)制，填補(bǔ)了長(zhǎng)期懸而未解的二型先天免疫識(shí)別知識(shí)缺口，拓展了對(duì)過(guò)敏發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)。

為了研究二型免疫的先天識(shí)別機(jī)制，徐墨實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一個(gè)以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的研究體系，旨在重建過(guò)敏原或寄生蟲在體內(nèi)誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的早期過(guò)程。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)想，如果能在培養(yǎng)皿中還原這一免疫啟動(dòng)過(guò)程，便可借助該體系開展兩類關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)：其一，以體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)二型免疫刺激的早期應(yīng)答為指標(biāo)，對(duì)成分復(fù)雜的過(guò)敏原、寄生蟲的提取物進(jìn)行活性追蹤純化，鑒定出其中誘發(fā)免疫反應(yīng)的核心活性成分；其二，利用CRISPR介導(dǎo)的高通量遺傳篩選，系統(tǒng)尋找宿主細(xì)胞中潛在的識(shí)別受體與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

為此，他們系統(tǒng)測(cè)試了數(shù)十種二型免疫刺激物，涵蓋過(guò)敏原、寄生蟲等各種來(lái)源，將其分別作用于十余種呼吸道上皮細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞、皮膚成角質(zhì)細(xì)胞等屏障細(xì)胞系，篩選是否可在體外激活二型免疫應(yīng)答的早期標(biāo)志。經(jīng)過(guò)大規(guī)模排列組合測(cè)試后，他們發(fā)現(xiàn)，一種經(jīng)典的霉菌過(guò)敏原——鏈格孢菌（Alternaria alternata）——可在體外培養(yǎng)的肺上皮細(xì)胞系中和小鼠呼吸道內(nèi)誘導(dǎo)三種相同的反應(yīng)：IL-33釋放、MAPK信號(hào)通路激活、以及多種二型免疫相關(guān)炎癥因子的表達(dá)（其中炎癥因子的表達(dá)依賴于MAPK通路激活），證明體外體系對(duì)體內(nèi)過(guò)程的有效重建。

Aeg-S 與 Aeg-L 是鏈格孢菌（A. alternata）的核心免疫激活成分的鑒定

鏈格孢菌是一種植物寄生真菌，廣泛分布于全球各地，夏秋季節(jié)其孢子隨空氣傳播，成為常見的呼吸道敏原。據(jù)流行病學(xué)研究，在某些地區(qū)，該霉菌可能與超過(guò)20%的季節(jié)性呼吸道過(guò)敏病例有關(guān)。

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)以鏈格孢菌提取物為起點(diǎn)，開展活性追蹤純化，通過(guò)六步層析分離，成功鑒定出核心免疫刺激活性組分。在純化過(guò)程中，誘導(dǎo)IL-33釋放、激活MAPK通路以及促炎基因表達(dá)這三種活性始終隨同洗脫（co-elute），證明它們?cè)醋酝活惞δ苄苑肿印＝?jīng)質(zhì)譜鑒定，該免疫刺激活性由兩個(gè)蛋白共同承擔(dān)。其中一個(gè)分子量約16.5 kDa，屬于aegerolysin家族。這類蛋白廣泛存在于真菌中，具有結(jié)合細(xì)胞膜上鞘磷脂和膽固醇的能力，據(jù)此將其命名為Aeg-S（aegerolysin small）。另一個(gè)蛋白為分子量約55 kDa，被命名為Aeg-L（aegerolysin large），它包含MACPF結(jié)構(gòu)域（membrane attack complex/perforin）。MACPF結(jié)構(gòu)域是一種保守的成孔結(jié)構(gòu)模塊，廣泛存在于免疫系統(tǒng)與微生物中的膜攻擊因子，可插入靶細(xì)胞膜形成孔道，引發(fā)細(xì)胞裂解。在多種真菌中，MACPF結(jié)構(gòu)域蛋白常與aegerolysin家族蛋白協(xié)同作用，組裝為二元多聚體穿孔毒素（binary pore-forming toxins），通過(guò)膜穿孔導(dǎo)致靶細(xì)胞破裂。值得一提的是，這類二元成孔系統(tǒng)不僅存在于鏈格孢菌，也廣泛分布于三大主要真菌過(guò)敏原屬：鏈格孢菌屬（Alternaria）、曲霉菌屬（Aspergillus）以及青霉菌屬（Penicillium），提示其在真菌過(guò)敏反應(yīng)中可能具有保守的致敏功能。

經(jīng)過(guò)反復(fù)嘗試，研究者們成功制備了具有活性的Aeg-S和Aeg-L重組蛋白，用于開展機(jī)制研究。中科院生物物理研究所高璞實(shí)驗(yàn)室結(jié)合體外重組和冷凍電鏡（cryo-EM）技術(shù)，解析了Aeg-S與Aeg-L協(xié)同形成的跨膜孔道結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制。Aeg-S和Aeg-L可特異結(jié)合富含鞘磷脂和膽固醇的脂質(zhì)體，并協(xié)同組裝形成16至20個(gè)重復(fù)單元的跨膜孔道復(fù)合物。該復(fù)合物呈大型環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在18聚體情況下，其外徑約232 ?，內(nèi)徑約為92 ?。每個(gè)重復(fù)單元由一分子Aeg-L和兩分子Aeg-S組成，沿孔道軸心呈對(duì)稱排列。這一高分辨率結(jié)構(gòu)揭示了Aeg-S與Aeg-L通過(guò)特定的分子配比與空間協(xié)作，在靶細(xì)胞膜表面完成組裝并實(shí)現(xiàn)膜穿孔的分子機(jī)制，為理解其如何誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的免疫激活過(guò)程提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

Aeg-S 與 Aeg-L（Aeg-S/L）孔道復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析

接下來(lái)，研究者們借助體外細(xì)胞培養(yǎng)體系解析了Aeg-S與Aeg-L的免疫激活機(jī)制。它們介導(dǎo)的膜穿孔可通過(guò)兩條途徑啟動(dòng)二型免疫反應(yīng)：一方面誘導(dǎo)IL-33的釋放，另一方面引發(fā)細(xì)胞外Ca2?內(nèi)流，繼而激活MAPK信號(hào)通路，并驅(qū)動(dòng)一系列下游炎癥基因的表達(dá)。Ca2?內(nèi)流是MAPK通路激活的必要前提，應(yīng)用Ca2?螯合劑可阻斷MEK和ERK的磷酸化，而使用MEK1/2抑制劑trametinib則可抑制炎癥基因的上調(diào)。與此同時(shí)，ATP等與二型免疫相關(guān)的alarmin也在刺激后被釋放。

更為關(guān)鍵的是，使用Aeg-S與Aeg-L重組蛋白就足以在小鼠體內(nèi)強(qiáng)烈誘導(dǎo)呼吸道過(guò)敏。將兩種蛋白聯(lián)合滴鼻刺激小鼠，6小時(shí)后，可在肺中觀察到與鏈格孢菌提取物刺激相同的早期應(yīng)答，包括上皮細(xì)胞釋放IL-33、MAPK信號(hào)通路的激活，以及下游炎癥因子的表達(dá)。若持續(xù)以Aeg-S和Aeg-L聯(lián)合刺激小鼠兩周，可在呼吸系統(tǒng)誘導(dǎo)典型的過(guò)敏性炎癥，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)、Th2細(xì)胞積累及血清IgE水平升高。相比之下，單獨(dú)使用Aeg-S或Aeg-L均無(wú)法誘導(dǎo)上述任何反應(yīng)，表明二者協(xié)同作用在細(xì)胞膜穿孔是導(dǎo)致過(guò)敏的基礎(chǔ)。與經(jīng)典一型/三型免疫佐劑脂多糖（LPS）對(duì)比表明，Aeg-S和Aeg-L具備專一的二型免疫佐劑特性。LPS可促進(jìn)呼吸道中抗原特異Th1和Th17應(yīng)答，但不誘導(dǎo)Th2或IgE生成；而Aeg-S與Aeg-L則專一輔助誘導(dǎo)抗原特異Th2及IgE反應(yīng)，卻不支持Th1或Th17應(yīng)答。

為評(píng)估Aeg-S與Aeg-L在鏈格孢菌誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)中的具體貢獻(xiàn)，研究者們借助真菌遺傳學(xué)手段，構(gòu)建了分別缺失aegs或aegl基因的鏈格孢菌突變株。用這些突變菌株的提取物反復(fù)滴鼻刺激小鼠兩周后發(fā)現(xiàn)，原本能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)二型免疫炎癥的野生型鏈格孢菌，在缺失Aeg-S或Aeg-L二者之一后，完全喪失了引發(fā)呼吸道Th2細(xì)胞積聚、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血清IgE升高的能力。值得注意的是，當(dāng)在突變菌提取物中回補(bǔ)了相應(yīng)的重組Aeg-S或Aeg-L蛋白后，其誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的能力得以重建。這些結(jié)果表明，Aeg-S與Aeg-L協(xié)同介導(dǎo)的細(xì)胞膜打孔構(gòu)成了該真菌的核心致敏機(jī)制。

在明確Aeg-S與Aeg-L通過(guò)成孔激活二型免疫反應(yīng)后，研究者進(jìn)一步提出假設(shè)：各種結(jié)構(gòu)各異的打孔毒素（pore-forming toxins, PFTs）是否普遍具有在誘導(dǎo)二型免疫應(yīng)答的能力？想要獲得來(lái)自諸多不同物種的具有活性的打孔蛋白難度極大，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)功底和對(duì)膜穿孔蛋白的理解有很高要求。幸而在邵峰實(shí)驗(yàn)室曾歡博士的努力下，研究團(tuán)隊(duì)篩選并獲得了六種額外的PFTs，包括來(lái)自經(jīng)典過(guò)敏原黑曲霉的NigA2和NigB1、具有過(guò)敏反應(yīng)潛能的?？舅谽qt II，以及來(lái)源于非典型過(guò)敏原的蚯蚓lysenin、杏鮑菇PlyA2和EryB、產(chǎn)氣莢膜梭菌PFO和硫黃菌LSL。它們靶向細(xì)胞膜上的不同分子組分，形成的穿孔直徑從約3納米至45納米不等。將這些PFTs以滴鼻方式反復(fù)刺激小鼠兩周后發(fā)現(xiàn)，盡管它們?cè)趤?lái)源、結(jié)構(gòu)和機(jī)制上各不相同，均可強(qiáng)有力的在呼吸道誘導(dǎo)過(guò)敏性炎癥。這表明，呼吸道上皮細(xì)胞膜的穿孔可被免疫系統(tǒng)識(shí)別為來(lái)自二型免疫刺激物的共通的“危險(xiǎn)特征”，由此啟動(dòng)相似的免疫應(yīng)答。這為理解多種含PFTs刺激物（包括霉菌及動(dòng)物毒素）共同誘導(dǎo)過(guò)敏提供了機(jī)制基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究解析了經(jīng)典霉菌過(guò)敏原鏈格孢菌誘導(dǎo)二型免疫反應(yīng)分子基礎(chǔ)，鑒定出其免疫激活活性主要由兩個(gè)協(xié)同作用的打孔蛋白Aeg-S與Aeg-L介導(dǎo)，并揭示了它們通過(guò)在呼吸道上皮細(xì)胞膜形成跨膜孔道啟動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制。更具普適意義的是，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，來(lái)自不同物種、結(jié)構(gòu)各異的多種打孔毒素均可通過(guò)類似機(jī)制誘導(dǎo)呼吸道過(guò)敏反應(yīng)，提示“細(xì)胞膜穿孔”可作為一種共同的免疫識(shí)別信號(hào)，引發(fā)二型免疫應(yīng)答。這為長(zhǎng)期缺乏了解的二型免疫先天識(shí)別機(jī)制提供了新的認(rèn)知。這些發(fā)現(xiàn)表明，與一型和三型免疫依賴于識(shí)別保守病原分子模式（如LPS、核酸等）不同，二型免疫似乎更傾向于感知結(jié)構(gòu)多樣的刺激物所引發(fā)的共同組織擾動(dòng)（tissue perturbation）。盡管既有研究表明某些打孔蛋白也可激活一型或三型免疫反應(yīng)，本研究首次明確指出在呼吸道環(huán)境中，膜穿孔可特異性誘導(dǎo)二型免疫。這也引發(fā)了有趣科學(xué)問(wèn)題：為何相同的膜損傷信號(hào)在不同組織或免疫微環(huán)境中會(huì)引發(fā)截然不同的免疫結(jié)局？可能的決定因素包括協(xié)同炎癥信號(hào)的組合或組織微環(huán)境的差異等。Aeg-S與Aeg-L構(gòu)建的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑檫M(jìn)一步解析“穿孔–感知–免疫激活”路徑以及研究二型先天免疫反應(yīng)的早期過(guò)程提供了新工具。

北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院徐墨研究員、中科院生物物理研究所高璞研究員為本論文的共同通訊作者，邵峰研究員為研究提供了關(guān)鍵支持。徐墨實(shí)驗(yàn)室的畢業(yè)生史可見博士、博士研究生呂垚，高璞實(shí)驗(yàn)室的趙春秋博士為論文的共同第一作者。邵峰實(shí)驗(yàn)室的曾歡博士、徐墨實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員王葉瓊為研究作出了重要貢獻(xiàn)。本論文的其他作者包括劉宇璇、李琳和陳涉博士。北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院的影像中心、蛋白質(zhì)中心，以及中科院生物物理研究所的生物影像與蛋白質(zhì)科學(xué)公共平臺(tái)為本研究提供了支持。本研究在北京生命科學(xué)研究所和中科院生物物理研究所完成，得到了北京市科委前沿創(chuàng)新培育項(xiàng)目（Z201100005320011, Z211100003321008, Z221100003422014，資助人：徐墨）、國(guó)家自然科學(xué)基金（32325028 和 32130057，資助人：高璞）以及北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院的資助。

論文鏈接

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09331-1